斑马鱼仔鱼中性粒细胞炎症疾病模型研究研究进展

关键词：斑马鱼中性粒细胞炎症性疾病模型

简介：中性粒细胞是人类最丰富的白细胞，在抵抗感染的第一道防线中发挥着至关重要的作用。 此外，中性粒细胞发育或功能缺陷是许多严重免疫缺陷的原因。 中性粒细胞功能障碍也与各种炎症病理有关。 近年来，人们认识到，除了经典定义的微生物杀伤功能（即吞噬作用、脱颗粒和坏死）之外，中性粒细胞还通过产生细胞因子以及与其他免疫和非免疫细胞相互作用来发挥多种功能。免疫细胞。 细胞功能。 最近的证据表明，中性粒细胞可以根据其微环境表达不同的表型。 此外，单细胞基因表达技术揭示了健康和疾病中的多个中性粒细胞亚群。 在通过免疫基因组（免疫基因组）项目对健康或发炎组织中的中性粒细胞进行的新分析中，研究人员提出，在健康条件下，来自多个组织的所有中性粒细胞状态都可以投射到一个称为“连续体”的连续体上。 根据来源组织和所使用的炎症刺激，来自发炎组织的中性粒细胞会偏离形成新的簇，这凸显了组织微环境在调节中性粒细胞表型和功能中的重要性。 因此，中性粒细胞功能最好在体内组织微环境中研究。 在过去的二十年中，斑马鱼已被广泛用作生物医学研究模型来阐明疾病机制，这很大程度上归功于胚胎透明性和可用的遗传工具。 成年斑马鱼的免疫系统十分发达，其功能性T细胞和B细胞谱系与哺乳动物相当，而受精后3-4周，幼鱼的先天免疫系统主要由巨噬细胞和中性粒细胞组成。 自2006年首次报道带有荧光标记中性粒细胞的斑马鱼以来，斑马鱼幼体模型已被广泛用于研究中性粒细胞在感染、炎症、组织修复和癌症中的功能。 例如，中性粒细胞的反向迁移有助于缓解炎症，实验室首先在幼虫尾鳍创伤模型中进行了描述，后来在小鼠身上得到了证实。 中性粒细胞反向迁移现在被认为是炎症消退的一个重要方面，并且可能是炎症信号传播到远处器官的机制。

斑马鱼幼虫中性粒细胞的形态特征表明它们可能是一个异质群体，其亚群可能不是完全成熟的中性粒细胞。 因此，在选择斑马鱼幼体模型来研究特定疾病机制时，需要仔细考虑斑马鱼幼体中性粒细胞与哺乳动物中性粒细胞的异同。 我们回顾了斑马鱼幼虫中性粒细胞发育和功能的数据，特别注意在哺乳动物中性粒细胞系统中建立最接近的对应物。 根据目前的证据，我们将讨论斑马鱼幼虫为推进中性粒细胞生物学提供的机会。

斑马鱼幼虫中性粒细胞的起源和寿命：在哺乳动物中，中性粒细胞由造血干细胞 (HSC) 的粒细胞祖细胞在骨髓 (BM) 中产生。 成熟的中性粒细胞不断释放到血液中，循环中的中性粒细胞通过迁移对炎症信号作出反应，即离开血流进入组织微环境执行多种功能。 在斑马鱼幼虫中，中性粒细胞是由原始造血和最终造血产生的。 原始造血发生在受精后 24 小时内 (hpf)。 随后，后血岛 (PBI) 中产生源自红系骨髓祖细胞 (EMP) 的中性粒细胞。 使用髓过氧化物酶 (mpo) 作为泛中性粒细胞标记，苏丹黑 (SB) 染色作为成熟中性粒细胞标记，在 24 hpf 时仅检测到 mpo+/SB- 未成熟中性粒细胞。 ，而第一个成熟的SB+中性粒细胞可以在35hpf时检测到。 在稳态条件下，到 48 hpf 时，所有中性粒细胞均为 mpo 和 SB 双阳性斑马鱼繁殖周期及过程，表明它们处于完全成熟状态。 中性粒细胞在受精后 2-3 天 (dpf) 时开始由位于背主动脉 (VDA) 腹壁的 HSC 产生，VDA 相当于哺乳动物的主动脉-性腺-中肾 (AGM)。 HSC 迁移到尾部造血组织（CHT，胎儿肝脏的哺乳动物对应物），并成为幼虫发育过程中中性粒细胞产生的主要部位。 VDA 和 CHT 产生的中性粒细胞被称为“幼虫粒细胞”，以区别于原始中性粒细胞，并且被认为与成体造血产生的中性粒细胞相似。 到 5 dpf 时，HSC 到达肾骨髓，在动物的整个生命周期中，中性粒细胞由 HSC 衍生的祖细胞产生，这一过程类似于哺乳动物的骨髓造血。

图 1：斑马鱼中性粒细胞发育。

乐等人。 使用谱系追踪仔细分析了 48 hpf 时粒细胞的起源，并证明了初级和最终 CHT 起源的中性粒细胞的共存。 有趣的是，在48hpf-72hpf之间，虽然原始骨髓祖细胞不再存在，但在缺乏确定造血功能的突变幼虫中，原始衍生的成熟中性粒细胞的数量翻倍，这表明成熟的Naive中性粒细胞保持增殖直至3dpf，或者有更多未成熟的中性粒细胞达到成熟度在 2-3 dpf 之间。 哺乳动物中性粒细胞增殖尚未被描述。 有趣的是，在中性粒细胞中，细胞周期标记被激活，表明有能力在成熟的中性粒细胞中启动有丝分裂信号。 由于原始中性粒细胞仅在 48 hpf 之前的短时间内产生，因此这些细胞的寿命决定了它们在幼虫中的持久性。 使用光转换荧光蛋白标记和测量 3 dpf 时斑马鱼幼虫组织中中性粒细胞半衰期的研究证据表明，幼虫组织中中性粒细胞的寿命为 5 天。 然而，在整个测量过程中，标记细胞的数量并未增加，这就提出了幼稚中性粒细胞在超过 3 dpf 后是否仍保持增殖潜力的问题。 然而，在幼虫生命的第一周，原始中性粒细胞可能持续存在于幼虫组织中。 由于大多数使用斑马鱼幼虫来研究中性粒细胞功能的研究都是在这个时间范围内进行的，因此研究人员将研究混合原始和最终衍生的中性粒细胞群体的功能，尽管没有证据表明原始中性粒细胞在功能上不同于从中性粒细胞产生的中性粒细胞。它们最终是派生出来的。 骨髓中循环中性粒细胞的假定半衰期仅为 6-12 小时，但在人体中则长达 5 天。 人们认为人体组织中的中性粒细胞寿命更长，但这很难测量。 大多数离开斑马鱼幼虫造血部位的中性粒细胞存在于组织中，只有少数存在于循环中。 在斑马鱼幼虫中测量的中性粒细胞寿命可能反映了在哺乳动物系统中看到的类似条件。 这表明幼虫斑马鱼中性粒细胞与哺乳动物组织中性粒细胞相当。 在哺乳动物中，中性粒细胞的产生因炎症信号传导的增加而增强。 所有现有的中性粒细胞在对抗细菌的过程中都会死亡，HSC 衍生的中性粒细胞过量产生，增强炎症信号和抗菌功能。 因此，这将斑马鱼幼虫作为研究调节需求驱动的粒细胞生成的机制以及感染后组织中中性粒细胞募集功能的相关模型。

斑马鱼幼虫中性粒细胞的核形态特征和成熟：中性粒细胞是快速移动的细胞，可以通过非常狭窄（~1μm）的内皮通道迁移到组织中，这也可以在斑马鱼幼虫到达时观察到。 这需要细胞直径和核形态的动态变形，这是通过核膜的特定组成来实现的。 多形核是人类和小鼠成熟中性粒细胞的特征，在斑马鱼中性粒细胞中也可见。

成年斑马鱼的肾脏和脾脏含有处于不同发育阶段的中性粒细胞，包括具有大而圆形核和弥漫核染色质的早幼粒细胞，以及具有2或3叶的成熟分叶状核。 中性粒细胞。 在斑马鱼幼体中，大多数中性粒细胞具有肾形细胞核，约15-25%具有双叶细胞核，少数具有多叶细胞核。 这些形态特征表明许多幼虫中性粒细胞是不成熟的，然而，尚未对 2-5 dpf 之间的幼虫中性粒细胞系统地进行核形态与其他成熟标记（例如苏丹黑信号）的直接比较。 相关性研究。 由于基因操作的简便性，可以在斑马鱼中探索调节中性粒细胞发育和成熟的机制。 与哺乳动物相比，斑马鱼中涉及中性粒细胞发育的关键途径是保守的，许多研究都将分析重点放在造血发育过程中产生的中性粒细胞的比例。 幼虫生命前 48 小时内原始中性粒细胞的发育独立于 HSC，这为揭示 HSC 经典转录因子 Runx1、cmyb 和 Cebp1 在中性粒细胞成熟中的功能作用提供了机会。 中性粒细胞成熟表型被评估为改变的核形态或中性粒细胞颗粒形成。 除了已知的中性粒细胞成熟相关基因外，还发现了新的调节因子。 廉等人。 研究表明，5-氨基乙酰丙酸合酶 1 (ALAS1) 是血红素生物合成途径的关键酶，是中性粒细胞成熟和正常功能所必需的。 Wu等人的研究表明，在Gfiaa突变鱼中，中性粒细胞祖细胞过度增殖和扩张，导致从幼鱼阶段开始就积累了具有肾形细胞核的未成熟中性粒细胞。 相反，miR-142-3p的缺失导致中性粒细胞数量减少，但胚胎中中性粒细胞成熟度增加，更多的中性粒细胞具有双叶或多叶细胞核。 这些中性粒细胞在迁移至炎症部位方面也存在缺陷。 班克斯等人。 表明表观转录组机制可能通过 Tet 蛋白调节中性粒细胞成熟，Tet 蛋白使 mRNA 去甲基化，导致其降解。 Tet2/3 突变导致细胞因子信号传导受到抑制，包括 JAK/STAT 信号传导，从而导致 3dpf 幼虫和成年斑马鱼中性粒细胞颗粒化和吞噬作用缺陷，但仍能正常迁移到伤口中。 尽管如此，这些研究表明，高分叶中性粒细胞迁移能力较差，但吞噬功能正常，而低分叶中性粒细胞在颗粒化和吞噬功能方面存在缺陷，但具有良好的迁移能力。 有一些证据表明哺乳动物中性粒细胞的核形态和功能之间存在类似的联系，但直接针对所有这些特性的研究仍然有限且尚无定论。 斑马鱼为实时成像提供了出色的遗传工具和特性，从而有助于剖析相关体内环境中中性粒细胞核形态、迁移和功能之间的关系。

斑马鱼幼虫中性粒细胞的功能特征：斑马鱼幼虫已被广泛用于模拟各种人类炎症病理，包括病毒、细菌和真菌感染、创伤和癌症。 这使得研究中性粒细胞生物学的几个功能方面成为可能，包括吞噬作用、坏死、迁移和炎症消退，揭示了人类和斑马鱼之间保守的功能机制以及一些新的发现，从而突出了斑马鱼幼虫作为研究模型的相关性体内中性粒细胞的功能。

中性粒细胞效应功能：通过吞噬作用清除病原体和受损组织对于宿主防御和组织修复至关重要。 荧光转基因报告鱼线还携带荧光标记细菌，能够对体内感染和伤口愈合过程中的中性粒细胞吞噬作用进行实时成像。 -Guyon 等人证明，中性粒细胞是直接反应者并吞噬体腔中表面相关的微生物，而巨噬细胞是清除血液中病原体的主要参与者。 几个例子表明，斑马鱼幼虫的中性粒细胞吞噬作用对于感染控制至关重要。 然而，在某些情况下，中性粒细胞不会杀死吞噬的细菌，而是可以为细菌传播提供细胞内生态位。 在斑马鱼幼虫的无菌组织损伤中也观察到中性粒细胞的吞噬行为，例如伤口和肿瘤发生； 然而，这种行为的功能后果尚不清楚。 中性粒细胞脱颗粒和活性氧产生是吞噬细胞内或细胞外病原体清除的两个主要效应功能。 例如，幼虫斑马鱼中性粒细胞可以吞噬并利用 NADPH 氧化酶来杀死受感染巨噬细胞中的分枝杆菌。 据报道，中性粒细胞在志贺氏菌感染中具有类似的清除作用。 Phan 等人已经证明，中性粒细胞还可以利用氧化机制在不直接接触的情况下消除病原体。 在大肠杆菌脊索感染模型中。

中性粒细胞胞外陷阱 (NET)：成熟激活的中性粒细胞的防御功能之一是释放中性粒细胞胞外陷阱 (NET)，它是由 DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成的纤维结构。 。 除了纯粹的抗菌功能外，在哺乳动物中，NET 已被证明在各种生理条件下发挥作用，例如癌症和心血管疾病。 有报道称，成年鱼和斑马鱼幼虫在受到创伤和细菌或真菌感染后会形成NET。 在斑马鱼幼虫中，NET 的形成与群体反应中早期中性粒细胞 DNA 的释放有关。 人类中性粒细胞对白色念珠菌反应的体外测试也存在类似的联系。 在感染的情况下，中性粒细胞焦亡似乎参与其中，并且是有效清除斑马鱼幼虫中细菌或真菌病原体所必需的。 因此，斑马鱼可以进一步作为模型来研究各种病理炎症条件下的功能，以确定斑马鱼的NETs是否与哺乳动物的NETs在功能上同源。 因此，幼虫斑马鱼中性粒细胞似乎概括了哺乳动物对应物在防御病原体方面的大部分功能。 然而，不同造血波产生的中性粒细胞可能存在的功能差异仍然难以捉摸。 如果没有区分不同成熟度的中性粒细胞的明确报告，确定成熟与未成熟中性粒细胞的功能贡献也是一个挑战。 一般来说，斑马鱼幼虫在 1-2 dpf 后，随着中性粒细胞的分化，其抵抗感染的能力变得更强。

中性粒细胞的募集及其在伤口愈合和再生中的作用：中性粒细胞是高度移动的细胞，虽然哺乳动物模型中的体内成像设备正在改进，但透明斑马鱼幼虫已经广泛用于研究中性粒细胞迁移到损伤部位和随后的解决炎症的发生称为逆向迁移。 斑马鱼幼虫受伤后，首先通过伤口释放的趋化信号从邻近组织招募中性粒细胞。 相比之下，在人类中，中性粒细胞从骨髓中动员起来是罕见的事件。 在稳定状态下，大多数成熟的中性粒细胞保留在 BM 中。 另一方面，即使在没有炎症的情况下，中性粒细胞也会渗透到组织中，这表明它们在维持组织稳态方面发挥着作用。 然而，组织中性粒细胞的作用以及调节其募集和保留的机制尚未完全了解。 斑马鱼幼虫中的中性粒细胞主要驻留在组织中，从而为研究中性粒细胞在组织中的迁移和功能提供了机会。 尾鳍损伤测定已广泛用于研究调节中性粒细胞趋化迁移的信号，最近还用于表征中性粒细胞聚集。 嗜中性粒细胞募集到损伤组织中可分为三个阶段(1)单个嗜中性粒细胞初始趋化至损伤部位，随后(2)远处嗜中性粒细胞趋化性增强，导致(3)嗜中性粒细胞积累。 对哺乳动物模型的研究表明，由于有效的旁分泌信号，中性粒细胞的募集既是一个自我放大又是自我限制的过程，使中性粒细胞有时间在募集和防御模式之间切换。 斑马鱼体内成像研究表明，到达坏死组织的中性粒细胞可以感知损伤信号ATP，从而触发一波钙警报信号。 该信号以接触依赖性方式通过连接蛋白 43 (Cx43) 半通道传播，触发化学引诱信号的合成。 近年来，中性粒细胞在组织修复中的功能备受关注。 尽管需要更多的研究来充分阐明中性粒细胞在不同组织修复过程中的功能作用，但中性粒细胞似乎通过调节受损组织内的多种细胞类型来发挥其促修复功能。 因此，使用标记中性粒细胞和其他相关细胞的多个报告基因来研究中性粒细胞如何与局部组织内的不同细胞类型相互作用将是有利的。

肿瘤中的中性粒细胞功能：中性粒细胞是各种肿瘤和肿瘤微环境中最常见的炎症细胞类型，即使在早期阶段也是如此，其高肿瘤内密度通常与不良预后相关。 肿瘤相关中性粒细胞 (TAN) 被分类为促炎抗肿瘤 N1 或促肿瘤 N2，IFNβ 和 TGFβ 被认为是决定其表型的关键因素。 然而，在癌症中，在血液和组织中发现了表现出一系列成熟状态的中性粒细胞，并且它们的成熟度和功能之间的联系仍然知之甚少。 转基因斑马鱼肿瘤模型的研究揭示了对转化细胞的早期炎症反应，表明中性粒细胞迅速被各种组织中的转化细胞吸引，包括皮肤、肝脏和大脑。 此外，涉及中性粒细胞耗竭或抑制的研究表明，这些细胞在肿瘤发生过程中具有促进肿瘤的作用，尽管有助于结直肠癌异种移植模型中的肿瘤清除。 与哺乳动物数据一致，即使在肿瘤发生期间，TGF-β似乎也能吸引中性粒细胞进入转化的肝细胞并促进免疫抑制。 在哺乳动物和斑马鱼中，参与中性粒细胞向伤口和炎症部位募集的多种细胞因子和其他介质也介导中性粒细胞向转化细胞和肿瘤微环境 (TME) 募集，包括 TNFα、IFN1、CXCR1 和 CXCR2 受体、IL8和H2O2。 此外，斑马鱼中性粒细胞响应转化细胞表达多种免疫抑制和营养基因，炎症介质前列腺素 E2 (PGE2) 由中性粒细胞亚群产生。 后一个发现表明，斑马鱼中性粒细胞可以对转化细胞产生异质反应，尽管迄今为止，在斑马鱼肿瘤模型中尚未定义不同的中性粒细胞亚群。 许多中性粒细胞对转化细胞的反应似乎在哺乳动物和鱼类之间是保守的。

结论和展望：在过去的十年中，斑马鱼幼虫模型为我们理解感染、炎症、组织损伤和癌症中中性粒细胞功能的调节机制做出了重大贡献。 斑马鱼和哺乳动物中性粒细胞的个体发育和成熟途径之间存在同源性。 斑马鱼幼虫为研究正常和病理组织条件下的中性粒细胞功能提供了理想的模型。 此外，斑马鱼幼虫的大量繁殖数量和较小的体型为抗炎药物的体内系统药物筛选提供了机会。 使用多宿主免疫细胞和病原体标记物对感染模型进行详细的体内成像分析和转录组分析，将有助于深入了解宿主/病原体相互作用中中性粒细胞功能的调节机制。 原始中性粒细胞在斑马鱼幼虫出生后第一周持续存在，目前它们与最终的造血中性粒细胞无法区分，并且可能有助于斑马鱼幼虫模型中描述的中性粒细胞功能。 迄今为止，主要通过耗竭或抑制中性粒细胞募集到发炎组织中来研究中性粒细胞在疾病模型中的功能。 在过去的几年中，中性粒细胞特异性/CAS9基因编辑系统进一步丰富了研究斑马鱼体内中性粒细胞功能的工具箱，使得研究中性粒细胞中的个体基因功能成为可能。 与疾病模型相比，在健康条件下对幼虫和成体中性粒细胞进行单细胞 RNA-seq 分析将成为斑马鱼中性粒细胞生物学的宝贵资源。 无创体内活体成像是使用斑马鱼幼虫模型的优势之一。 无创体内实时成像是使用斑马鱼幼虫模型的优势之一。 未来几年，更多工具将进一步增强斑马鱼幼体模型研究组织中性粒细胞功能的能力。

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