光滑爪蟾 中国专利：抗菌肽与革兰阴性菌外膜的抗菌活性

【技术领域】

[0001] 本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种非洲爪蟾皮肤抗菌肽及其制备方法和用途。

【背景技术】

[0002] 抗菌肽，又称抗微生物肽，是由免疫系统释放的具有抗菌活性的物质。 它们作为先天免疫成分的一部分广泛存在于自然界的生物体中。 抗菌肽是具有广泛生物活性的小分子多肽，包括杀菌、抗炎、抗病毒、抑制肿瘤等作用。 它们是生物非特异性防御​​系统的重要组成部分。 抗菌肽具有广谱抗菌活性，能与革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖和革兰氏阳性菌表面的肽聚糖结合，从而破坏细胞膜，形成跨膜通道，引起细胞渗漏内容物或离子流出。 高渗破裂死亡后，不易产生耐药性。 因此，抗菌肽作为生物活性高、不易产生耐药性的小分子肽，具有极其广泛的应用价值。

[0003] 两栖动物裸露的皮肤与生活环境直接接触，没有鳞片、甲壳和毛发的保护。 然而，在两栖动物的皮肤表面，往往会覆盖有粘液物质，形成保护屏障。 这种屏障含有大量结构相对复杂的大分子物质和功能多样的抗菌活性物质。 抗菌肽作为成分，发挥着重要作用。

抗菌肽作为抗菌药物的研究已经广泛而深入。 其中，小分子抗菌肽的研究成果尤为显着。 小分子抗菌肽不仅具有高效的抗菌活性，而且由于其分子结构简单，合成成本较低。 、没有免疫反应等优点。 在公开号为103641901A的中国专利中，公开了一种序列为GLPLLI SWIKRKRQQAGPGSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM的抗菌肽。 在公开号为102140130A的中国专利中，公开了一种序列为KCRRRKVHGPMIRIRKK的抗菌肽。 上述两种抗菌肽的序列和二级结构较长，导致其合成困难且成本较高。 在公开号为103524602A的中国专利中，公开了一种序列为RRRffffC的6肽抗菌肽。 但该发明仅阐明了其病毒活性，并没有阐明其抗肿瘤等其他作用，而且该专利也没有对这种抗菌肽进行研究。 该肽的溶血活性极大地限制了其应用。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种滑爪蟾皮肤抗菌肽及其制备方法和用途。

本发明解决现有技术中存在的技术问题所采用的技术方案是：本发明的滑爪蟾皮抗菌肽由4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸组成，序列为Asp - Glu-Asp-Asp-Asp 是 DEDDD 的 5 肽。

本发明还可以采用以下技术措施：本发明的爪蟾皮肤抗菌肽由4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸组成，序列为Asp-Glu-Asp-Asp-Asp，即DEDDD 5肽，其分子量为607.7Da。

本发明的光爪蟾皮肤抗菌肽的制备方法，包括以下步骤： A、提取光爪蟾皮肤分泌物； B.制备型高效液相色谱分离纯化； C.制备液相分离峰进行活性检测； D.分析高效液相色谱分离纯化； E.分析液相分离峰的活性检测和质谱鉴定。

[0017] 所述步骤A中，物理刺激非洲爪蟾皮肤后得到非洲爪蟾皮肤分泌物。

[0010] 所述的物理刺激为恒压电刺激，电压为15-20V。

本发明的爪蟾皮肤抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

[0012] 本发明的爪蟾皮肤抗菌肽在制备细菌引起的抗菌药物中的应用。

[0013] 本发明的光爪蟾皮肤抗菌肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0014] 本发明的爪蟾皮肤抗菌肽在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明的优点和积极效果是：本发明采用物理方法刺激皮肤，极大地保护了抗菌肽的结构完整性和生物活性。 其次，本发明公开的抗菌肽为小分子肽，有利于皮肤吸收，大大降低了化学合成的难度和成本，增强了其应用的可能性。 最后，本发明的抗菌肽抗菌活性显着，溶血活性低，抗乳腺癌细胞活性良好，无毒副作用，不易产生耐药性，大大增强了应用范围。 基于上述优点，本发明提供的抗菌肽可以应用于工业化生产。

【图片说明】

图1为本发明爪蟾皮肤抗菌肽的色谱图； 图2为本发明非洲爪蟾皮肤抗菌肽的质谱图； 图3为本发明爪蟾皮肤抗菌肽的固相合成色谱图； 图4为本发明光爪蟾抗菌肽的固相合成质谱图； 图5为本发明光爪蟾抗菌肽在不同浓度下的溶血率； 图6为本发明光爪蟾抗菌肽在不同浓度下对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率。

【详细方式】

本发明的非洲爪蟾皮肤抗菌肽由4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸组成，序列为Asp-Glu-Asp-Asp-Asp，即DEDDD的5个肽，其分子分子量为607. 7Da，命名为XLAsp-Pl。

1.本发明的非洲爪蟾皮肤抗菌肽是通过以下方法制备的： 1. 1.获取非洲爪蟾皮肤分泌物。 取100只非洲爪蟾，用蒸馏水清洗皮肤表面，去除杂质。 使用15V直流电间歇性刺激皮肤表面，诱导皮肤分泌。 约10分钟后，可见皮肤分泌更多无色透明物质，其中夹杂着白色粘液状物质。 使用15-20V之间的直流电压即可达到上述分泌效果。 用超纯水收集分泌物，12000rpm离心15min，除去沉淀，取上清液。 上清液经0.45 μm滤膜过滤后，用10 KDa超滤管以12,000 rpm离心20 min，去除大分子蛋白。 采用金黄色葡萄球菌ATCC29213检测粗提物的抗菌活性。 使用冷冻干燥机浓缩粗提取物，然后储存在-40°C。

1.2 制备型高效液相色谱分离纯化半制备型C18柱与仪器连接，流动相A（上样缓冲液，水+0.05%TFA）、B（洗脱缓冲液，乙腈+0.05%TFA）仪器的泵。 调整仪器，用液体A平衡系统，直至吸收值达到平衡。 然后设置自动进样量为2mL/次，自动采集程序为2min/管，流速为2mL/min。 并根据预实验的结果，设定洗脱程序，如下表1所示。 多次上样，同时混合各组分，然后浓缩。

1. 3 液相分离峰活性检测的制备以金黄色葡萄球菌S. aureusATCC29213为活性检测用菌株，采用药敏片法体外检测分离峰活性。 将菌液稀释至0.5麦克法兰浊度后，取100ML，涂于直径90mm的细菌培养皿中。 待风干时，将各分离峰制成的药敏片贴在琼脂表面，37℃温热。 在盒子中孵育过夜，并根据抑制区的存在和大小确定分离峰的活性和强度。 活性分离峰将被进一步分离。 1.4 分析型高效液相色谱分离纯化为了确定各个活性峰中的活性物质，并获得纯度较高的样品，以方便测序实验，我们采用分析型高效液相色谱（Analytical High Performance Liquid Chromatography，分析型HPLC）仪器进一步分离活性峰。 首先将分析型C18柱连接到仪器上，并将流动相A（上样缓冲液，水+0.05%TFA）、B（洗脱缓冲液，乙腈+0.05%TFA）连接到仪器的泵上。 相应地。 调试仪器，分别吹扫泵A和泵B，并用液体A平衡系统，直至吸收值达到平衡。 设置流速为1mL/min，手动上样100uL/次，根据吸收峰手动采集。 多次加载样品，合并相同的峰并浓缩。 洗脱程序设置如表2所示，不同样品根据第一次洗脱效果改变洗脱程序。

1.5 液相分离峰分析活性检测和质谱鉴定活性检测方法同1.3。 使用MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定具有抗菌活性的分离峰，包括分子量和纯度。 首先，将 1 μL 分离的样品和肽标准品分别点样在抛光的靶标上。 风干后，将1 μL饱和α-CCA基质（溶剂：0.1%三氟乙酸+50%乙腈）添加到样品表面，自然干燥。 MALDL-T0F/T0F采用正离子和自动采集模式来收集数据。 首先，使用肽标准品进行校准，并将质量扫描范围设置为0-4KDa，以获得样品的初级质谱。 通过分析质谱，可以获得更高纯度（高达95%）的成分，用于氨基酸序列的测定。 最后分离出符合要求的4-9峰抗菌肽，其色谱图和质谱图如图1和图2所示。

2、光爪蟾皮肤抗菌肽氨基酸序列的测定是通过分离纯化、质谱鉴定，对符合测序要求的抗菌肽进行氨基酸测序。 ABI491氨基酸序列分析仪的原理是Edman降解法：首先将异硫氰酸苯酯与多肽的N端残基偶联，形成苯氨基硫代羧基肽（PTC-肽）； 然后PTC-肽发生环化裂解反应，形成噻唑烷酮苯胺氨基酸（ATZ-AA）； 最后，经过转化反应，ATZ-AA转化为苯基异硫脲氨基酸(PTH-AA)。 通过比较微梯度输送系统（毛细管HPLC）与标准PTH-AA的保留时间，利用数据分析软件获得抗菌肽的氨基酸序列。

3、光爪蟾皮肤抗菌肽序列的生物信息学分析对生物信息学数据库NCBI()和Antimicrobial PeptideDatabase(APD)两大数据库进行检索和比较，确定获得的光爪蟾皮肤抗菌肽序列。 与任何已知序列都不同，因此可以判断

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